Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод ферментативного получения ампликонов (большого количества копий) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити); при этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК (при условии его присутствия в данном образце), поскольку только этот участок соответствует заданным условиям.

Метод ПЦР идеально подходит для обнаружения микроорганизмов, трудно визуализирующих, медленно растущих или сложных в культивировании. ПЦР является наиболее предпочтительным методом для диагностики заболевания в острый период. Основным лимитирующим фактором при использовании ПЦР является содержание в исследуемой пробе достаточного количества материала (нуклеиновой кислоты возбудителя). Для многих возбудителей известно, что их количество в крови меняется с течением времени; таким образом, в какой-то момент времени ПЦР может показать ложноотрицательный результат у инфицированного пациента. Таким образом, для врача крайне важно знать тропность возбудителя к тканям организма и отправлять на исследование тот материал, в котором вероятность обнаружения возбудителя наиболее высока (например, мочу – при диагностике лептоспироза, плаценту или пунктат семенников при подозрении на бруцеллез, синовиальную жидкость – при исследовании на боррелиоз).

К техническим недостаткам этого метода можно отнести возможность ложноотрицательных результатов из-за присутствия ингибиторов реакции в пробе, а также возможность ложноположительных результатов вследствие контаминации. Кроме того, данный метод не всегда подходит для оценки эффективности лечения, поскольку ПЦР выявляет как живые микроорганизмы, так и их «останки».

ПЦР-тесты проводятся следующим образом:

1. Из образца ткани или жидкости животного (например, кровь, моча, фекалии) выделяется ДНК.
2. Затем ДНК амплифицирует (копируется) в лаборатории с помощью специальных реагентов и оборудования.
3. После амплификации полученные копии ДНК анализируются, чтобы определить, присутствуют ли в них специфические последовательности, характерные для определенного патогена.
4. Результаты теста интерпретируются специалистами, которые могут сделать вывод о наличии или отсутствии инфекции у животного.

ПЦР-тесты являются очень точными и чувствительными, что делает их одним из наиболее предпочтительных методов диагностики многих заболеваний у животных.

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) – это метод амплификации ДНК в одной пробирке, который позволяет проводить молекулярную диагностику быстрее и дешевле, чем ПЦР. Этот метод может быть использован для диагностики РНК-вирусов, включая туберкулез. Долгое время основным методом амплификации нуклеиновых кислот оставалась полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако современные подходы к молекулярной диагностике (например, point-of-care) требуют более простых, быстрых и дешевых способов получения результатов, чем ПЦР. В связи с этим был разработан целый ряд методов изотермической амплификации нуклеиновых кислот. И самым популярным из них на сегодняшний день является петлевая изотермическая амплификация ДНК (LAMP).

Метод LAMP имеет несколько преимуществ перед ПЦР:

1. Быстрота: LAMP может быть выполнен всего за 30-60 минут, в то время как ПЦР обычно занимает от 90 до 120 минут.
2. Простота: LAMP требует меньше оборудования и реагентов, чем ПЦР, что делает его более доступным для использования в полевых условиях.
3. Чувствительность: LAMP может обнаруживать очень низкие концентрации ДНК, что делает его полезным для диагностики инфекционных заболеваний.
4. Специфичность: LAMP может быть настроен на обнаружение специфических последовательностей ДНК, что делает его более точным, чем ПЦР.
5. Устойчивость к ингибиторам: LAMP менее чувствителен к ингибиторам, таким как гемоглобин и нуклеазы, что делает его более надежным методом диагностики.

Существует несколько типов ПЦР, каждый из которых используется для разных целей:

1. Обычная ПЦР (полимеразная цепная реакция): это стандартный метод, который используется для амплификации определенных участков ДНК.
2. Реал-тайм ПЦР (Real-time PCR): этот метод используется для количественного определения ДНК или РНК в образце. Он включает в себя использование флуоресцентных зондов, которые позволяют отслеживать количество амплифицированной ДНК в реальном времени.
3. ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (RT-PCR): этот метод используется для амплификации РНК, которая сначала должна быть преобразована в ДНК с помощью обратной транскрипции.
4. Мультиплексная ПЦР: этот метод позволяет одновременно амплифицировать несколько различных участков ДНК в одном образце.
5. Инвертированная ПЦР: этот метод используется для амплификации больших фрагментов ДНК.
6. ПЦР с мечеными праймерами: этот метод используется для определения точного положения амплифицированного участка ДНК на хромосоме.

Геномные исследования с применением ChIP-qPCR

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) в сочетании с RT-qPCR считается базовым методом в геномных исследованиях, его коммерческая доступность и высокая точность позволяет быстро и легко анализировать взаимодействия белок-ДНК. ChIP-qPCR применяют для исследований конкретных генов и потенциальных регуляторных областей, таких как промоторы. Этот метод в настоящее время используется в разных исследованиях, включая клеточную дифференцировку, молчание генов-супрессоров и влияние модификаций гистонов на экспрессию генов.

Анализ ChIP охватывает только часть возможных мишеней, присутствующих по всему геному из-за вариабельности эффективности сшивания и стерического ограничения доступности антител.

Для проведения ChIP-qPCR необходимо добавить master mix (смесь ферментов и нуклеотидов), праймеры и матричную ДНК. При этом нужно точно подобрать концентрацию праймеров для эффективной амплификации целевой ДНК. В качестве матрицы выступает либо ChIP ДНК, либо, в случае отрицательного контроля, пустые бусины без ДНК. Затем необходимо подобрать время и температуру циклов отжига, и запустить ПЦР. Результаты анализируют аналогично результатами кПЦР, сравнивая пороговое число циклов (Ct) для матрицы ввода и матрицы ДНК ChIP.